Основные  результаты, полученные в ИБФМ РАН в 2023 г.

1.6.3. – Биологическое разнообразие и биоресурсы

Всероссийская коллекция микроорганизмов (руководитель д.б.н. Л.И. Евтушенко)

Развитие фонда ВКМ

• Каталожный фонд ВКМ пополнен 242 штаммами микроорганизмов, принадлежащих к 69 родам и более 120 идентифицированным видам, отсутствующим или слабо представленным в ВКМ и других коллекциях страны. В числе включенных в фонд культур 144 штамма бактерий (в т.ч., 60 штаммов актиномицетов) и 98 штаммов мицелиальных и дрожжевых грибов.

• Проведена плановая проверка жизнеспособности у более 3000 штаммов фонда ВКМ, сохраняемых различными методами (лиофилизация, криоконсервация в жидком азоте; хранение в стерильной почве и под вазелиновым маслом). Законсервированы и заложены (перезаложены) на хранение штаммы со сниженными показателями жизнеспособности.

• Выполнены работы по таксономической ревизии и ре-идентификации культур фонда ВКМ в соответствии с современной системой. С использованием методов МАЛДИ масс-спектрометрии, секвенирования фрагментов ДНК и полных геномов идентифицировано (ре-идентифицировано) боле 800 штаммов микроорганизмов различных групп. Подтверждены видовая и родовая аффилиации для большинства культур, обнаружено более сотни потенциально новых видов и несколько новых родов. Подтверждена правомочность выделения советскими (российскими) учеными большого числа новых видов в домолекулярный период микробиологии.

Научные исследования

• Охарактеризованы и описаны новый род дрожжей Rasporella, ассоциированных с насекомыми, и новый род бактерий Alkalisalibacterium, обнаруженных в донных отложениях содово-соленого озера (Республика Бурятия). Описаны новые анаэробные виды Methanobacterium shpitsbirgense (археи) и Pelosinus baikalensis (бактерии), найденные в многолетнемерзлых отложениях острова Западный Шпицберген и холодных пресноводных озерах. Из арктических криопэгов выделены и частично охарактеризованы анаэробные психроактивные бактерии других родов - Acetobaсterium, Labilibaculum и Trichococcus.

• Описано семь новых видов актиномицетов рода Kribbella, происходящих из почв различных регионов России; предложено дополненное и исправленное описание рода. Впервые у представителей рода обнаружены спорангиеподобные структуры. Установлено, что клеточные стенки криббелл содержат специфичные для видов комбинации уникальных гликополимеров (разные по структуре тейхуроновые и/или тейхулозоновые кислоты); у всех видов присутствует разветвлённый маннан – хемотаксономический маркер рода.

• Результаты изучения гликополимеров клеточной стенки актиномицетов в таксономическом аспекте выявили специфичные для рода и видов Rathayibacter (Microbacteriaceae) наборы гликополимеров. Штаммы каждого вида содержат разветвленные рамноманнаны или/и рамнаны (различающиеся по структуре и включающие рамнозу в D-конфигурации); большинство видов имеют дополнительно тейхуроновые кислоты. В отличие от Rathayibacter, для Curtobacterium характерен неразветвленный L-рамнан в сочетании с кислыми полисахаридами, а для Clavibacter – пируватсодержащий галактоманнан и разные галактофурананы.

• Исследованы физиологические свойства клинически значимых дрожжевых грибов Candida albicans, C. parapsilosis и C. tropicalis - наиболее распространенных оппортунистических видов, ассоциированных с инвазивной кандидозной инфекцией, часто обнаруживаемых в плодоовощной продукции. Результаты исследования дрожжей вышеупомянутых видов, выделенных из плодов овощных и фруктовых растений, показали, что среди них присутствуют штаммы, устойчивые к антимикотикам группы азолов. Больше всего устойчивых штаммов было выявлено среди изолятов вида C. tropicalis, они оказались также наиболее активными продуцентами протеаз и фосфолипаз.

• Проанализировано современное состояние проблемы биоразложения нитроцеллюлозы, как опасного промышленного отхода, в том числе с использованием сульфатвосстанавливающих бактерий и микромицетов. Наиболее перспективными микроорганизмами с точки зрения эффективности процесса деградации нитроцеллюлозы являются бактерии рода Desulfovibrio, грибы Fusarium solani и Sclerotium rolfsii и их консорциумы. Приводятся сведения о ферментах, участвующих в процессе деградации, возможных механизмах реакций, а также о влиянии на процесс добавления в реакционную смесь доноров и акцепторов электронов.

Лаборатория радиоактивных изотопов (руководитель к.б.н. И.И. Мустахимов

• Экспериментально установлена метаболическая гибкость метанотрофов класса Gammaproteobacteria, расширяющая  биотехнологический потенциал как продуцентов полиуглеродных соединений из метана благодаря способности штамма к быстрому и продуктивному росту на природном газе. У Methylomonas rapida MP1T обнаружены гены синтеза каротиноидов, свидетельствующие о перспективности метанотрофа в качестве продуцента обогащенного каротиноидами кормового белк,. Получен тройной мутантный штамм Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z-3E (ΔfumIΔfumCΔmae) по генам, кодирующим яблочный фермент и два ортолога фумаразы, способный при росте на метане накапливать 2,6 ммоль фумарата ∙ г^-1 сухих клеток.)

Лаборатория биологии плазмид (руководитель чл.-корр. А.М. Боронин)

Выделены и охарактеризованы новые ризосферные бактерии, устойчивые к тяжелым металлам (цинку, кадмию, свинцу) и способные к супрессии фитопатогенных грибов и бактерий. В геноме штамма-нефтедеструктора R. qingshengii F2-2 на плазмиде pLP156 обнаружены кластер генов биосинтеза феназинов (антибиотиков), гены биосинтеза растительных гормонов: ауксинов и гиббереллинов, способствующих фитостимуляции. Показано, что этот штамм колонизирует листья и корни рапса и горчицы, стимулирует рост растений, обладает антагонистической активностью в отношении фитопатогенных микромицетов: Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum и Gaeumannomyces graminis var tritici. Обнаруженные фитостимулирующие свойства штамма F2-2 свидетельствуют о его перспективности для использования в биотехнологиях защиты сельскохозяйственных растений и повышения их урожайности

1.6.8. Биохимия, биофизика и структурная биология

Лаборатория регуляции биохимических процессов (руководитель д.б.н. Кулаковская Т.В.)

ВНТК  трехмерных структур микроорганизмов (руководитель к.б.н.. Дмитриев В.В.)

• Процесс взаимодействия  клеток дрожжей рода Candida с малорастворимыми гидрофобными субстратами, является эффективной экспериментальной моделью для понимания механизмов формирования биопленок и инвазии в клетки хозяина при патогенезе.  Впервые установлено, что у типовых штаммов C. albicans, С. tropicalis и C. maltosa при росте на гексадекане образуются специфические включения неорганических полифосфатов в клеточной стенке, а также экзовезикулы, содержащие эти биополимеры. Обработка специфической полифосфатазой Ррх1 приводит к исчезновению полифосфатов в везикулах и клеточной стенке, что фиксируется как с помощью флуоресцентной так и электронно-сканирующей микроскопии, а также  к высвобождению фосфата в инкубационную среду. Предположено, что полифосфаты как полианионы являются матрицей для иммобилизации окислительных ферментов как в клеточной стенке, так и в составе везикул.

Микрофотография клеток C. tropicalis,  выращенных на среде с гексадеканом, шкала – 5 мкм. Окраска ДАПИ при высокой концентрации (50 мкМ) приводит к оранжевой флуоресценции структур, содержащих неорганические полифосфаты (верхний рисунок, видны включения в клеточной стенке и агломераты  внеклеточных везикул),  при обработке препаратов биомассы полифосфатазой Ррх1 внеклеточные полифосфаты подвергаются гидролизу и оранжевая флуоресценция исчезает.

Лаборатория энзиматической деградации органических соединений  (руководитель к.б.н. М.П. Коломыцева)

Впервые обнаружен новый внутримолекулярный канал у алкалофильных грибных лакказ, ведущий извне вглубь молекулы к одному из каталитических остатков аспартата при Т2-атоме меди Т2/Т3-активного центра. Показано, что во всех алкалофильных грибных лакказах, в отличие от типичных кислых грибных лакказ, аминокислотные остатки, выстилающие этот канал, положительно заряжены как в кислой, так и в нейтральной среде, что указывает на скопление протонов вблизи каталитического центра, которое может служить дополнительным донором протонов, необходимых для функционирования лакказы в ходе каталитического процесса в нейтрально-щелочных условиях среды.

1.6.6  Функциональная микробиология

Лаборатория биохимии клеточной поверхности микроорганизмов (руководитель к.б.н. Н.В. Леонтьевская)

• Обнаружен, выделен и частично охарактеризован новый бактериолитический фермент - N-ацетилмурамоил-L-амидаза. Фермент лизирует живые клетки Micrococcus luteus, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Bacillus thuringiensis и Bacillus megaterium. На основе этого фермента разработан образец липосомального антимикробного препарата. Установлено, что в составе липосом литическое действие N-ацетилмурамоил-L-амидазы увеличивается. Дальнейшая разработка липосомальной формы актуальна для создания антимикробного препарата на основе бактериолитического фермента для внутреннего применения для лечения инфекцией, вызванных в т.ч. антибиотико-устойчивыми формами патогенов.

1.6.9. Молекулярная биология, молекулярная генетика и геномные исследования

Лаборатория энзимологии генетических процессов (руководитель к.б.н. И.Э. Грановский)

• Исследована новая линия клеток SSs, поддерживающая размножения широкого спектра вирусов, в частности вируса африканской чумы свиней (АЧС). Данная линия не требует адаптации полевых изолятов вируса АЧС, в том числе вирулентных, и обеспечивает их репродукцию на высоком уровне - >10^7,0 TCID₅₀/ ml, а также способствует проявлению феномена гемадсорбции и цитопатического эффекта. Проведён анализ транскриптов ряда маркерных генов и определён уровень экспрессии мРНК CD163 и Siglec1 – белков поверхности макрофагов, предположительно являющихся рецепторами вируса АЧС. В результате была впервые показана способность вируса АЧС реплицироваться в стволовых клетках свиньи in vitro. В перспективе иммортализация клеток SSs позволит получить новую линию клеток свиньи, поддерживающих размножение вируса АЧС.

Лаборатория биологии вирусов бактерий (руководитель к.б.н. А.М. Шадрин)

• Протестирована возможность использования фагов для консервирования коровьего молока с помощью бактериофага. Для оценки эффективности фага Kirov для предотвращения контаминации пищевых продуктов проведены испытания на коровьем молоке, контаминированном штаммом АТСС 4342. Через 4 ч титр АТСС 4342 в образце с фагом снизился ниже порога обнаружения 10² КОЕ/мл, тогда как в контрольном образце титр бактерий возрастал до 10⁸ КОЕ/мл. В образцах, содержащих как фаг, так и клетки, титр фага увеличивался до 10⁸ БОЕ/мл.

• 1.6.12. Биотехнология и синтетическая биология
• 
  

Лаборатория биосенсоров (руководитель д.х.н. А.Н. Решетилов)

• Исследован микробиологический способ восстановления оксида графена – уникального наноматериала с широким спектром применения (медицина, электроника, биосенсорика и пр.). Промышленное получение графена основано на химическом и термическом восстановлении оксида графена, обладающем существенными недостатками (использование токсичных химикатов, специальных энергоемких реакторов и пр.). В лаборатории разработан простой, эффективный и экологически чистый метод синтеза оксида графена с помощью уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans, основанный на их способности катализировать гидроксилирование и окисление ароматических углеводородов за счет наличия гем-содержащих белков. Полученный материал использован при создании микробных биосенсоров и биотопливных элементов с высокой чувствительностью и эффективностью.

Возможный механизм микробного восстановления оксида графена и вид сигналов биосенсоров на его основе.

Лаборатория микробиологической трансформации органических соединений (руководитель д.б.н. М.В. Донова)

• Впервые реализована гетерологическая экспрессия гена уникального мутантного цитохрома CYP102A1-LG23 в клетках M. smegmatis BD для осуществления синтеза 9a-гидроксиандрост-4-ен-3,17-диона (7β-OH-AД) из андрост-4-ен-3,17-диона (АД). Ферментативная активность рекомбинантных миколицибактерий была увеличена за счет повышения количества активной формы фермента и конструирования системы регенерации кофакторов, ставших ключевыми факторами, ограничивающими превращение АД в 7β-ОН-АД в M. smegmatis. Максимальный выход целевого продукта достигнут в культуре клеток M. smegmatis BD (pVP2), коэкспрессирующих гены cyp102A1-LG23 и gdh. Полученные результаты вносят вклад в понимание каталитических особенностей рекомбинантных цитохромов P450 и могут служить отправной точкой для разработки биотехнологий производства ценных 7β-гидроксистероидов.