Тема: «Новое поколение биопрепаратов на основе наноматериалов и ризосферных бактерий, стимулирующих рост растений (PGPR), для улучшения урожайности и питания сельскохозяйственных растений»

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 24 сентября 2014 г. № 14.613.21.0016 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014–2020 годы» на этапе № 2 в период с 1 января по 30 июня 2015 г. выполнялись следующие работы:

По п.2.1 Плана-графика (ПГ): проведено исследование метаболического профиля выделенных ризосферных бактерий (феназины, HCN, индолил-3-уксусная кислота, биосурфактанты).
По п.2.2 ПГ: проведено исследование устойчивости ризосферных бактерий к тяжелым металлам, галотолерантности, способности к фиксации азота и растворению фосфатов.
По п.2.3 ПГ: проведен скрининг выделенных ризосферных штаммов на способность стимулировать рост растений и защищать их от фитопатогенов.
По п.2.4 ПГ: проведена идентификация штаммов, наиболее перспективных для стимуляции роста и защиты растений, с помощью современных молекулярно-генетических методов (Rep-PCR, геномный фингерпринтинг, секвенирование генов 16S рРНК).

При этом были получены следующие результаты:

1. Краткое описание основных полученных результатов

В результате проведения экспериментальных исследований отобраны и идентифицированы новые, перспективные для создания биопрепаратов штаммы PGPR Pseudomonas, обладающие комплексом полезных для растений свойств: защита растений от фитопатогенных грибов родов Gaeumannomyces, Fusarium, Rhizoctonia за счет продукции феназиновых антибиотиков (феназин-1-карбоновой кислоты, феназин-1-карбоксамида, 2-гидроксифеназина) и цианида водорода; продукция фитогормонов ауксинов, биосурфактантов, фосфатмобилизующая активность, галотолерантность.
Исследование метаболического профиля ризосферных бактерий показало, что из 18 отобранных на первом этапе штаммов 10 продуцировали феназиновые антибиотики. 6 штаммов (BS1393, 16Н, P4-1, Kr31, IG1, OV17), относящихся к виду P. chlororaphisпродуцировали феназин-1-карбоноваю кислоту и 2-гидроксифеназин (подтверждено с помощью масс-спектрометрии). Два штамма, принадлежащие к виду P. fluorescens (A1 и IC7) продуцировали только феназин-1-карбоновую кислоту, а штамм О9-10 феназин-1-карбоновую кислоту и феназин-1-карбоксамид. Штамм P. chlororaphis О3-3 продуцировал только феназин-1-карбоксамид. Качественная реакция на цианид водорода показала, что из 18 исследованных штаммов бактерий 11 штаммов (P4-1, P4-2, O9-10, O3-3, Kr21, Kr31, IG1, OV17, 16H, BS1393, 38a) продуцировали цианид водорода, о чем свидетельствует появление синего окрашивания фильтров после выращивания бактерий. Исследуемые ризосферные штаммы синтезировали от 3 до 18 мкг/мл ауксинов. Наибольшее количество ауксинов (10.2–17.6 мкг/мл) накапливалось в культуральной жидкости штаммов, принадлежащих к виду P. chlororaphis(штаммы P4-1, Kr31, IG1, OV17, BS1393, 16H, Оr3-3) и P. putidaP8-2. 8 штаммов (P2-1, P4-1, Р4-2, IG1, OV17, OV29, BS1393, 38a) продуцировали поверхностно активные вещества. ПН при их культивировании снижалось в 1.8–2.5 раза относительно контроля (среды без культивирования бактерий) и находилось в пределах от 40±4 до 29±0.4 мН/м.
Исследование устойчивости к тяжелым металлам и галотолерантности показано, что из 18 отобранных ризосферных штаммов 12 росли при повышенных концентрациях (5%) хлористого натрия в среде выращивания. Все 18 ризосферных штаммов имели низкий уровень устойчивости (1−2 мМ) к сульфату меди, а также сульфату цинка (кроме штаммов P8-2 и IC7). 5 штаммов устойчивы к низким концентрациям хлорида никеля: P2-1 (Ni 2 мМ), OV29 (1 мМ); P8-2, Kr21 и IC7 (0.5 мМ). Только два штамма P2-2 и P8-2 имели низкий уровень устойчивости к нитрату кадмия (0.5 мМ). Все исследованные штаммы были чувствительны к сульфату кобальта (МТК менее 0.5 мМ). Показано, что 12 исследуемых штаммов способны растворять гидроксиапатит кальция, причем 9 штаммов (38a, 16H, Kr21, OV29, P2-2, P2-1, P6-1, O9-10, P4-2) обладают выраженной фосфатмобилизующей активностью. Отобранные штаммы были не способны к фиксации атмосферного азота.
Выделенные штаммы были способны стимулировать рост растений и защищать их от фитопатогенов. В условиях искусственного фитопатогенного фона R. solani (2 г мицелия/кг грунта) инокуляция проростков огурца ризосферными штаммами P. chlororaphis Or3-3 и P4-1 обеспечивала прирост массы корней на 16–27% и надземной части на 15–24% по сравнению с неинокулированными растениями. Следует отметить, что в чистом грунте без внесения R. solaniинокуляция проростков огурца штаммом P. chlororaphis Or3-3 обеспечила прирост массы корней на 17% и надземной чсти на 30% по сравнению с неинокулированными растениями. Учитывая фитостимулирующие и антагонистические свойства данного штамма подана заявка на патент РФ.
Идентификация штаммов с помошью современных молекулярно-генетических методов (геномный фингерпринт с BoxA1 праймером, определения нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, MALDI Biotyper метод) показала, что 17 отобранных на первом этапе проекта штаммов относятся к флюоресцирующим псевдомонадам. Среди них можно выделить три эволюционно близкие группы бактерий: P. putida, P. fluorescensи P. chlororaphis. Один из штаммов (рабочий номер P2-2) согласно секвенированию гена 16S рРНК идентифицирован как Serratiaproteamaculans (Serratialiquefaciens). Поскольку представители этого рода относятся к условно-патогенным микроорганизмам, этот штамм исключен из дальнейших исследований.
Геномный фингерпринт является не очень распространеным методом идентификации бактерий, но наличие фингерпринта исследуемого штамма очень важно для слежения за судьбой этого штамма в полевых испытаниях.

2. Оценка элементов новизны научных, конструкторских и технологических решений, информация о полученных на отчетном этапе охраноспособных РИД

В настоящее время актуальными задачами для повышения урожайности сельскохозяйственных культур остается выделение новых эффективных штаммов бактерий для защиты и стимуляции роста растений, исследование их влияния на растения в различных почвенно-климатических условиях РФ, в том числе и на территориях, загрязненных различными токсикантами, определение видовой специфичности воздействия. Мы предполагаем, что реализция данного проекта позволит создать дешевые высокоэффективные и экологически безопасные биопрепараты на основе новых штаммов микроорганизмов с самыми различными сочетаниями полезных свойств, необходимых для повышения устойчивости растений и восстановления природных агробиоценозов.
Охраноспособные результаты интеллектуальной деятельности (РИД), полученные в рамках данного прикладного научного исследования: Изобретение заявка № 2015118653 от 20.05.2015 «Штамм бактерий Pseudomonas chlororaphis ВКМ В-2956D для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий и стимуляции роста растений», РФ.

3. Оценка соответствия полученных результатов техническим требованиям к выполняемому проекту и перспектив продолжения работ по проекту

Полученные результаты соответствуют требованиям Технического задания на выполнение проекта (п.п. 3.10.1–3.10.4) и Плану-графику исполнения обязательств.
В ходе выполнения проекта разработаны следующие документы:
1) Паспорта природных штаммов PGPR Pseudomonas (5 штаммов), улучшающих рост растений за счет различных механизмов (Приложения А–Д);
2) Заявка на патент РФ на новый штамм P. chlororaphis Or3-3 – продуцент биологически активных метаболитов для защиты и улучшения роста растений (Приложение Е);
3) Перечень ризосферных штаммов бактерий, обладающих фитостимулирующими свойствами (Приложение Ж);
4) Перечень нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК перспективных штаммов, депонированных в базу данных GenBank (Приложение И).
Подготовлен Отчет о патентном поиске.
Полученные результаты являются заделом для проведения экспериментальных исследований, касающихся влияния наночастиц железа(III) на физиологию ризосферных бактерий и растений.
Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Этап 1