Лаборатория биохимии клеточной поверхности микроорганизмов


Заведующая лабораторией, к.б.н., вед.н.с. Леонтьевская Наталья Валерьевна

e-mail: vasilyevanv@rambler.ru

Лаборатория сформирована в самостоятельную структуру в 2005 г., ранее являлась частью отдела регуляции биохимических процессов, руководителем которого был чл.-корр. РАН И.С. Кулаев. В настоящее время руководителем лаборатории является к.б.н. Леонтьевская Наталья Валерьевна.

Научные сотрудники лаборатории

·

к.б.н., н.с.

Леонтьевская Елена Алексеевна

e-mail: ealeont@gmail.com

к.б.н., с.н.с.

Кудрякова Ирина Валерьевна

e-mail: kudryakovairina@yandex.ru

н.с.

Афошин Алексей Сергеевич

alex080686@mail.ru

Основные направления и достижения лаборатории

 

Исторически важным наследием лаборатории является открытие в 1975 году грамотрицательной бактерии Lysobacter sp. XL1 (сейчас Lysobacter capsici XL1). Эта бактерия обладает антимикробным действием в отношении грамположительных бактерий, дрожжей, грибов, простейших. Антимикробная активность штамма обусловлена действием комплекса секретируемых за пределы клетки бактериолитических ферментов. Бактериолитические ферменты гидролизуют основой структурный компонент клеточных стенок бактерий – пептидогликан. По специфичности действия на бактериальные пептидогликаны внеклеточные бактериолитические ферменты этой бактерии являются эндопептидазами, амидазами, мурамидазами.

Сейчас исследования в лаборатории ведутся по нескольким направлениям. В период с 2016 по 2022 гг получены новые важные результаты.

1.      Изучение продуцентов бактериолитических ферментов

Изучены условия продукции антимикробных агентов у Lysobacter capsici VKM B-2533Т и L. gummosus 10.1.1. Проведены транскриптомные и геномные исследования этих бактерий, а также L. capsici XL1 и L. capsici XL2. Эти исследования позволили обнаружить гены как уже известных бактериолитических ферментов, так и установить гены-кандидаты новых бактериолитических ферментов.

2.      Выделение и характеристика бактериолитических ферментов Lysobacter

Из культуральной жидкости штамма VKM B-2533Т выделено шесть бактериолитических ферментов: α-литическая протеаза, β-литическая протеаза (Blp), три бактериолитические сериновые протеазы (Serp, Serp6, Serp7) и N-ацетилглюкозаминидаза. Четыре последних не были изучены ранее. Особый интерес представляет фермент Blp, который обладает мощной литической активностью в отношении живых клеток стафилококка, включая клинический изолят Staphylococcus aureus 55 (MRSA). Это свойство определяет высокую практическую ценность Blp.

Расширена характеристика Blp L. capsici VKM B-2533Т. Выявлена широкая субстратная специфичность Blp как в отношении белковых субстратов, так и бактериальных клеток-мишеней (Схема 1). Впервые решена пространственная структура Blp. Установлено, что Blp имеет структурные различия с ближайшим гомологом белком LasA Pseudomonas aeruginosa. Установлено, что Blp обладает более широким спектром антимикробного действия, чем LasA. Предположено, что это может быть обусловлено выявленными структурными отличиями.

 

Схема 1. Бактериолитический фермент Blp обладает мощной литической активностью в отношении живых клеток бактерий, а также протеазной активностью в отношении белковых субстратов.

 

Решены структуры гомологичных бактериолитических ферментов Л1 и Л5 L. capsici XL1. При наложении этих структур друг на друга у Л5 обнаружены два интересных участка, которые могут быть важны для понимания различий в субстратной специфичности этих ферментов.

Установлена интересная особенность взаимодействия бактериолитического фермента Л1 L. capsici XL1 с ингибитором сериновых протеаз AEBSF. Методами структурного и биохимического анализов показано, что часть молекул белка Л1 взаимодействует с ингибитором необратимо по известному механизму (Рисунок 1а), а другая часть – обратимо за счет формирования слабых водородных связей (Рисунок 1б). Данная работа важна для изучения в дальнейшем механизма взаимодействия бактериолитических ферментов с клеточной стенкой клеток-мишеней, который до сих пор не известен.

 


Рисунок 1. Особенности взаимодействия бактериолитического фермента Л1 Lysobacter sp. XL1 с ингибитором AEBSF. (а) Необратимое ингибирование за счет ковалентной связи Ser144 активного центра Л1 с ингибитором AEBSF. (б) Часть молекул Л1 взаимодействуют обратимо за счет водородных связей Ser144 активного центра Л1 с ингибитором AEBSF.


3.      Изучение внешнемембранных везикул бактерий рода Lysobacter 

 

Бактерии рода Lysobacter, как и все грамотрицательные бактерии, образуют внешнемембранные везикулы. Везикулы L. capsici XL1 и L. capsici VKM B-2533T обладают выраженным антимикробным действием в отношении бактерий, грибов, дрожжей. Изучены особенности биогенеза везикул L. capsici XL1 и предложена модель их образования. Основная идея заключается в том, что для формирования везикул необходимы два условия: наличие зон дестабилизации во внешней мембране клеток и факторы инициации образования везикул. Факторы инициации - это компоненты внутреннего содержимого везикул. Для антимикробных везикул L. capsici XL1 установлено, что зоны дестабилизации – это области во внешней мембране, обогащенные кардиолипином, а один из факторов инициации – это бактериолитический фермент Л5 (Схема 2). Роль белка Л5 в качестве фактора инициации подтверждена в т.ч. с помощью делеции его гена. В результате, мутантный штамм L. capsici XL1ΔalpB::tet формирует меньшее количество везикул. А везикулы, обладающие антимикробным действием, вовсе не образуются. Участие секретируемого белка в биогенезе везикул было установлено впервые.

Установлено, что вся антифунгальная активность культуральной жидкости L. capsici VKM B-2533T принадлежит везикулам. Среди всего пула везикул этой бактерии обнаружена отдельная субпопуляция антифунгальных везикул. Антифунгальный агент, который находится в везикулах, предстоит еще установить.

Схема 2. Модель биогенеза везикул L. capsici XL1.

 

4. Разработка высокоэффективных систем экспрессии для бактериолитических ферментов

До недавнего времени не было ни одной эффективной экспрессионной системы для бактериолитических ферментов грамотрицательных бактерий. Недавно нами разработана первая в мире гомологичная система экспрессии для бактериолитического фермента Blp L. capsici VKM B-2533T (Схема 3). В результате, выход Blp у экспрессионного штамма увеличился в 8.5 раз по сравнению с L. capsici дикого типа. Успешно масштабирован процесс культивирования рекомбинантного штамма L. capsici PT5-blp. В условиях ферментации выход Blp увеличился еще в 1.6 раза по сравнению с лабораторными условиями. На основе разработанной экспрессионной системы созданы системы экспрессии и для других бактериолитических ферментов как установленных нами ранее, так и выявленных с помощью транскриптомных исследований. Разработанная гомологичная система экспрессии позволяет получать бактериолитические ферменты в количестве достаточном для их всестороннего изучения, включая испытания этих белков в качестве лекарственных антимикробных препаратов.

 

Схема 3. Разработана гомологичная экспрессионная система для бактериолитического
фермента Blp на основе штамма L. capsici P T5 -blp (экспрессия гена blp под контролем
промотора бактериофага Т5).

 

5. Разработка антимикробных препаратов

Еще в прошлом веке на основе культуральной жидкости L. capsici XL1 был разработан антимикробный препарат лизоамидаза. Лизоамидаза была разрешена для использования в медицине в качестве наружного антимикробного средства. До сих пор лизоамидаза не имеет отечественных и зарубежных аналогов. Препарат был отмечен грамотами и наградами, защищен патентами.

В последнее время получены новые важные результаты. Установлено, что везикулы, полученные из культуральной жидкости L. capsici XL1, обладают лечебным действием в отношении сибиреязвенной инфекции и стафилококкового сепсиса, смоделированных у экспериментальных животных. Этот результат послужил толчком для разработки липосомальных форм антимикробных препаратов на основе бактериолитических ферментов (Схема 4). Также ведутся исследования по разработке антимикробных препаратов на основе отдельных бактериолитических ферментов и их комплексов для медицины и ветеринарии. Активно разрабатываются биологические средства защиты растений на основе продуцентов бактериолитических ферментов.

 

 

Схема 4. Схема получения липосомальных антимикробных препаратов, содержащих бактериолитические ферменты Lysobacter.
Патенты

 

Патент РФ № 2745653. Применение Т5 промотора для экспрессии гена бета-литической протеазы Lysobacter capsici VKM B-2533Т и штамм L. capsici blp PТ5-продуцент данной протеазы. Авторы: А.С. Афошин, И.В. Кудрякова, Е.А. Леонтьевская, Н.В. Леонтьевская.

Основные публикации за 2016 – 2022 годы

Статьи

  1. 1. Kudryakova I.V., Shishkova N.A., Vasilyeva N.V. Outer membrane vesicles of Lysobacter sp. XL1: biogenesis, functions, and applied prospects // Appl Microbiol Biotechnol. – 2016. – V.100. – №11. – p. 4791 – 4801. doi: 10.1007/s00253-016-7524-6. Impact factor 5.560. (Q1). WOS/Scopus
  1. 2. Tishchenko S., Gabdulkhakov A., Melnik B., Kudryakova I., Latypov O., Vasilyeva N., Leontievsky A. Structural Studies of Component of Lysoamidase Bacteriolytic Complex from Lysobacter sp. XL1 // Protein J. – 2016. – V.35. – №1. – p. 44 – 50.  doi: 10.1007/s10930-015-9645-7. Impact factor 4.000. (Q2). WOS/Scopus 
  1. 3. Кудрякова И.В., Сузина Н.Е., Винокурова Н.Г., Шишкова Н.А., Васильева Н.В. Изучение факторов биогенеза везикул Lysobacter sp. XL1 // Биохимия. – 2017. – Т. 82. – № 4. – с. 677 – 686. DOI: 10.1134/S0006297917040125. Impact factor 2.824. (Q3). WOS/Scopus
  1. 4. Kudryakova I.V., Gabdulkhakov A.G., Tishchenko S.V., Lysanskaya V.Y., Suzina N.E., Tsfasman I.M., Afoshin A.S., Vasilyeva N.V. Structural and functional properties of antimicrobial protein L5 of Lysоbacter sp. XL1 // Appl Microbiol Biotechnol. – 2018. – V.102. – №11. – p.10043 – 10053. doi: 10.1007/s00253-018-9364-z. Impact factor 5.560 (Q1). WOS/Scopus
  1. - 2019 - V.80. – p. 89 – 94. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2019.02.013. Impact factor  4.885
  1. 6. Afoshin A. S., Kudryakova I. V., Borovikova A. O., Suzina N. E., Toropygin I. Y., Shishkova N. A.,  Vasilyeva N. V. Lytic potential of Lysobacter capsici VKM B-2533T: bacteriolytic enzymes and outer membrane vesicles // Sci Rep. – 2020. – V.10. – №1. – 9944. doi: 10.1038/s41598-020-67122-2. Impact factor 4.996 (Q1). WOS/Scopus
  1. 7. Afoshin A.S., Konstantinov M.A., Toropygin I.Y., Kudryakova I.V., Vasilyeva N.V. β-Lytic Protease of Lysobacter capsici VKM B-2533T // Antibiotics (Basel). – 2020.– V.9. – №11. – 744. doi: 10.3390/antibiotics9110744. Impact factor 5.222 (Q1). WOS/Scopus
  1. 8. Tarlachkov S.V., Kudryakova I.V., Afoshin A.S., Tutukina M.N., Leontyevskaya E.A., Vasilyeva N.V. Draft Genome Sequence of the Type Strain Lysobacter capsici VKM B-2533 // Microbiol Resour Announc. – 2021.– V.10. – №3. – 10(3):e01194-20. doi: 10.1128/MRA.01194-20. CiteScore 1.5 (Q3). WOS/Scopus
  1. 9. Kudryakova I.V., Afoshin A.S., Ivashina T.V., Suzina N.E., Leontyevskaya E.A., Leontyevskaya (Vasilyeva) N.V. Deletion of alpB Gene Influences Outer Membrane Vesicles Biogenesis of Lysobacter sp. XL1 // Front Microbiol. – 2021. – V.12. - p. 715802. doi: 10.3389/fmicb.2021.715802.  Impact factor 6.064 (Q1). WOS/Scopus

Данная статья вошла в сборник Frontiers e-book «What Is known and What Remains To Be Discovered About Bacterial Outer Membrane Vesicles, Volume II»: Kudryakova I.V., Afoshin A.S., Ivashina T.V., Suzina N.E., Leontyevskaya E.A., Leontyevskaya (Vasilyeva) N.V. Deletion of alpB Gene Influences Outer Membrane Vesicles Biogenesis of Lysobacter sp. XL1 in Frontiers e-book What Is known and What Remains To Be Discovered About Bacterial Outer Membrane Vesicles, Volume II. Contreras-Rodriguez A., Garduno R., Yanez A. (eds). 2022. – Lausanne: Frontiers Media SA. – p. 31 – 40. doi: 10.3389/978-2-83250-525-0.

  1. 10. Kudryakova I., Afoshin A., Leontyevskaya E., Leontyevskaya (Vasilyeva) N. The First Homologous Expression System for the beta-lytic Protease of Lysobacter capsici VKM B-2533T, a Promising Antimicrobial Agent // Int J Mol Sci. – 2022. – V.23. – p. 5722. doi: 10.3390/ijms23105722. Impact factor 6.208. (Q1). WOS/Scopus
  1. 11. Tarlachkov S.V., Kudryakova I.V., Afoshin A.S., Leontyevskaya E.A., Leontyevskaya (Vasilyeva) N.V. Whole-Genome Sequencing of Lysobacter capsici VKM B-2533T and Lysobacter gummosus 10.1.1, Promising Producers of Lytic Agents // Microbiol Resour Announc. – 2022. – V.11. – №9. – e0048422. doi: 10.1128/mra.00484-22. CiteScore 1.5 (Q3). WOS/Scopus\
  1. 12. Afoshin A., Tishchenko S., Gabdulkhakov A., Kudryakova I., Galemina I., Zelenov D., Leontyevskaya E., Saharova  S., Leontyevskaya (Vasilyeva) N. Structural and Functional Characterization of beta−lytic Protease from Lysobacter capsici VKM B−2533T // Int J Mol Sci. – 2022. – V.23. – p. 16100. doi.org/10.3390/ijms232416100. Impact factor 6.208 (Q1). WOS/Scopus

СМИ о нас (кино)

  1. 1. Пресс-релиз, который осветила команда научно-познавательного журнала PCR News «Протеаза L5 определят антимикробные свойства везикул бактерии Lysobacter sp. XL1» на оригинальную публикацию Kudryakova I.V., Afoshin A.S., Ivashina T.V., Suzina N.E., Leontyevskaya E.A., Leontyevskaya (Vasilyeva) N.V. Deletion of alpB Gene Influences Outer Membrane Vesicles Biogenesis of Lysobacter sp. XL1. https://pcr.news/novosti/proteaza-l5-opredelyat-antimikrobnye-svoystva-vezikul-bakterii-lysobacter-sp-xl1/
  1. 2. Пресс-релиз, который осветила команда пресс-служба РНФ «Не просто груз: белок Л5 оказался важным для образования «бактериальной бомбы» Lysobacter sp. XL1» на оригинальную публикацию Kudryakova I.V., Afoshin A.S., Ivashina T.V., Suzina N.E., Leontyevskaya E.A., Leontyevskaya (Vasilyeva) N.V. Deletion of alpB Gene Influences Outer Membrane Vesicles Biogenesis of Lysobacter sp. XL1. https://www.rscf.ru/news/release/ne-prosto-gruz-belok-l5-okazalsya-vazhnym-dlya-obrazovaniya-bakterialnoy-bomby-lysobacter-sp-xl1/#:~:text=%D0%9E%D0%BA%D0%B0%D0%B7%D0%B0%D0%BB%D0%BE%D1%81%D1%8C%2C%20%D1%87%D1%82%D0%BE%20%D0%B1%D0%B5%D0%B7%20%D0%B1%D0%B5%D0%BB%D0%BA%D0%B0%20%D0%9B5,XL1.
  1. 3. Пресс-релиз, который осветила команда научно-познавательного журнала PCR News «Продукцию антибактериального белка повысили с помощью новой экспрессионной системы» на оригинальную публикацию Kudryakova I., Afoshin A., Leontyevskaya E., Leontyevskaya (Vasilyeva) N. The First Homologous Expression System for the β-Lytic Protease of Lysobacter capsici VKM B-2533T, a Promising Antimicrobial Agent. https://pcr.news/novosti/produktsiyu-antibakterialnogo-belka-povysili-s-pomoshchyu-novoy-ekspressionnoy-sistemy/
  1. 4. Интервью Кудряковой И.В. телеканалу 360о как лауреата Премии Губернатора Московской области в сферах науки, технологии, техники и инноваций для молодых ученых и специалистов:

1 часть:  https://youtu.be/vKeUNiLHvFQ

2 часть: https://youtu.be/rxw4d4hUkUY

3 часть:  https://youtu.be/gvRgOOl6iIU

Премии и награды

  1. 1. Победитель программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» – 2011 (г. Тула) и 2015 (г. Владимир).
  1. 2. Дипломы за лучшую работу на конференции молодых ученых – 2012, 2013, 2014, 2015 (ИБФМ РАН, г. Пущино).
  1. 3. Диплом I степени за лучший устный доклад на конференции «Молодежь в Науке 2014» (г. Минск, Беларусь).
  1. 4. Лауреат премии имени Георгия Константиновича Скрябина, ИБФМ РАН, 2014, 2018 (г. Пущино).
  1. 5. Победитель гранта молодых ученых для поездки на конференцию «FEMS 2015» (г. Маастрихт, Голландия), «FEBS 2018» (г. Прага, Чехия), «FEMS 2019» (г. Глазго, Шотландия), «FEBS 2021» (онлайн конференция из-за пандемии).
  1. 6. Победитель конкурса работ молодых ученых, посвященного Празднику труда в Московской области, в номинации «Научно-исследовательские работы молодых ученых» (2019 г.) (г. Пущино).
  1. 7. Стипендия Президента РФ 2019 – 2021 гг.
  1. 8. Победитель конкурса 2019 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными 2019 – 2021 гг.
  1. 9. Призер конкурса научных работ, проводимого в рамках Пущинской конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», 2016, 2019, 2021 и 2022 гг (г. Пущино).
  1. 10. Победитель конкурса 2022 г. на право получения грантов Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук в научном направлении.
  1. 11. Благодарственное письмо от Дома ученых города Пущино за участие в научно-просветительской программе «Молодые ученые Пущино», осуществленной в 2021 году в рамках мероприятий Года науки и технологий в Российской Федерации.
  1. 12. Лауреат премии Губернатора Московской области в сферах науки, технологии, техники и инноваций для молодых ученых и специалистов в 2022 году.

Грантовая поддержка за 2016 – 2022 годы

  1. 1. Грант Минобрнауки России «Получение препаратов рекомбинантных гидролитических ферментов для кормоподготовки и ветеринарии» (соглашение №14.607.21.0013); 2014 – 2016 гг.
  1. 2. РНФ 19-74-00086 «Транскриптомный подход для поиска перспективных литических агентов Lysobacter capsici ВКМ-2533Т». 2019 – 2021 гг.
  1. 3. Стипендия Президента РФ СП-2175.2019.4 «Разработка антимикробных препаратов нового поколения». 2019 – 2021 гг.
  1. 4. Грант Президента РФ МК-1864.2022.1.4 «Поиск, выделение и характеристика нового бактериолитического фермента Lysobacter sp. XL1, перспективного для биомедицины в качестве альтернативы антибиотикам». 2022 – 2024 гг.
  1. 5. Грант Минобрнауки России «Разработка подходов для профилактики и преодоления резистентности бактерий к противомикробным препаратам» (соглашение №075-10-2021-113); 2021 – 2023 гг. 

 

vasilyevanv@rambler.ru


142290 Московская область, г.Пущино, пр-т Науки, д.5, Тел.: +7(4967)733962,  adm@ibpm.ru, www.ibpm.ru

Разработка сайта - Alces