14.607.21.0013

 

ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ О ПРОЕКТЕ

Работы по проекту «Получение препаратов рекомбинантных гидролитических ферментов для кормоподготовки и ветеринарии» (соглашение о предоставлении субсидии № 14.607.21.0013 от 05.06.2014) осуществляется на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН). Данный проект выполняется в рамках реализации федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы» (протокол заседания Конкурсной комиссии, созданной приказом Минобрнауки России от 20 декабря 2013 г. № 1379, от 06 мая 2014 г. № 2014-14-579-0001-3).

Проект направлен на разработку новых технологических подходов для развития сельского хозяйства путём разработки новых ферментных препаратов для животноводства: В результате реализации проекта будут получены следующие результаты

- Разработаны новые препараты на основе рекомбинантных гидролаз бактериального происхождения с повышенной осахаривающей способностью. Способствует глубокому гидролизу некрахмалистых полисахаридов животных кормов растительного происхождения с увеличением их питательности.

- Разработаны новые препараты на основе рекомбинантных бактериолитических гидролаз для лечения и профилактики заболеваний животных. Способствует разложению клеточных стенок патогенных бактерий и не являются антибиотиками.

Успешность реализации проекта обеспечивается: высокой квалификацией коллектива исполнителей (исполнителями проекта являются кандидаты и доктора наук), обладающих опытом выполнения аналогичных проектов и большим количеством научных статей; наличием необходимого для выполнения проекта оборудования у ИБФМ РАН.

 

ПУТИ РЕАЛИЗЦИИ ПРОЕКТА

В настоящее время происходит массовое секвенирование геномов микроорганизмов. В GeneBank уже опубликованы тысячи геномов различных организмов, в том числе бактерий. Многие из аннотированных генов кодируют гидролитические ферменты и практически не изучены. Всероссийская коллекция микроорганизмов является одной из крупнейших коллекций микроорганизмов в мире и является одним из подразделений ИБФМ РАН. В коллекции депонированы десятки видов бактерий, для которых опубликованы геномы. Это открывает возможность получения новых ферментных препаратов для сельского хозяйства, обладающих новыми свойствами. В ходе выполнения работы планируется получение новых ферментных препаратов на основе рекомбинантных гидролаз, полученных с помощью единого технологического подхода. Технологический подход выполнения работы состоит из следующих стадий: поиск генов гидролаз среди геномов тех видов бактерий, штаммы которых депонированы в ВКМ; клонирование отобранных генов и получение рекомбинантных гидролаз; изучение свойств рекомбинантных гидролаз и отбор гидролаз с наиболее полезными с практической точки зрения свойствами; разработка ферментных препаратов на основе отобранных ферментов.

Запланированные работы:

1. Поиск, клонирование и анализ генов гидролаз различных штаммов бактерий, депонированных во Всероссийской коллекции микроорганизмов.

2. Получение рекомбинантных продуцентов, наработка рекомбинантных гидролаз, изучение свойств рекомбинантных гидролаз.

3. Разработка ферментных препаратов и их испытание.

 

ХОД ВЫПОЛНЕНИЯ ПРОЕКТА.

Этап1 . Выбор направления исследований. Анализ геномов, культивирование бактерий, клонирование генов.

Проведён отбор генов, кодирующих осахаривающие и бактериолитические гидролазы, у бактерий с опубликованными геномами, которые депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ). Штаммы бактерий, в геноме которых найдены гены гидролаз, были отобраны для дальнейшей работы. Всего отобрано 19 штаммов. В геномах отобранных штаммов обнаружено 277 генов, кодирующих осахаривающие и батериолитические гидролазы. Гены гидролаз были охарактеризованы по наличию уникальных доменов, сайтов активных центров, сигнальных пептидов, на основании чего сделаны выводы о функции гидролаз. Проведено культивирование отобранных бактериальных штаммов, получена биомасса бактерий, из биомассы выделены препараты ДНК. На основании анализа последовательностей генов гидролаз разработаны праймеры для проведения ПЦР. С помощью ПЦР были наработаны гены осахаривающих и бактериолитических гидролаз, проведено клонирование генов. Всего клонировано 103 гена. Выполнено секвенирование генома бактерии Lysobacter sp. XL1, которая продуцирует комплекс бактериолитических гидролаз. Проведено аннотирование генома. Обнаружено 5507 генов, кодирующих белки, тРНК, рРНК, тмРНК. Идентифицировано пять генов, кодирующих бактериолитические гидролазы. Проведено патентное исследование в области проводимых исследований. Проведено исследование рынков осахаривающих и бактериолитических препаратов. Созданы проекты бизнес-планов производства и продажи препаратов на основе осахаривающих и бактериолитических гидролаз.

 Этап 2. Получение рекомбинантных продуцентов гидролаз.

Были написаны праймеры для клонирования генов гидролаз в экспрессионный вектор. Получено 31 рекомбинантный штамм на основе E.coli, 9 рекомбинантных штаммов на основе Kluyveromyces lactis, 58 рекомбинантных штаммов на основе Pichia pastoris. Исследована продукция осахаривающих и бактериолитических гидролаз рекомбинантными продуцентами. Обнаружено, что гидролазы эффективно экспрессируются в рекомбинантных продуцентах на основе E. coli и Pichia pastoris, но не в Kluyveromyces lactis. Всего получено 55 рекомбинантных продуцентов гидролаз: 24 на основе E. coli и 31 на основе Pichia pastoris. Всего получено продуцентов: 12 ксиланаз, 11 протеаз, 3 фитазы, 9 лизоцимов, 5 бета-глюкозидаз, 5 амилаз, 10 целлюлаз. Разработаны лабораторные методики получения рекомбинантных продуцентов.

Этап 3. Изучение свойств ферментных препаратов.

Разработаны методики очистки рекомбинантных гидролаз. В результате очистки были получены препараты гидролаз в электрофоретически гомогенном состоянии. Результаты измерения концентрации белка показали, что минимальное количество полученного белка было 3,1 мг, что соответствует ТЗ. С помощью электрофореза определены молекулярные массы полученных белков. Большинство значений молекулярной массы находилось в пределах 30 – 50 кДа. Только несколько белков обладали молекулярной массой менее 20 кДа и более 97 кДа. Всего получены препараты 55 белков. Проведена отработка методик тестирования активности осахаривающих и бактериолитических гидролаз. На основании разработанных методик разработаны программы исследовательских испытаний рекомбинантных гидролаз. Проведены испытания рекомбинантных гидролаз и отобраны гидролазы с оптимальными свойствами. Проверены различные условия получения кристаллов гидролаз. Получены кристаллы десяти рекомбинантных гидролаз.

Проведён отбор рекомбинантных гидролаз с оптимальными свойствами для создания ветеринарного и осахаривающего препаратов. Рекомбинантные гидролазы отличаются высокой удельной активностью, высокой термостабильностью, оптимальными для работы значениями рН оптимума.

Этап 4. Получение ферментных препаратов и испытание их свойств.

Проведена отработка способов получения ферментных препаратов. В ходе культивирования рекомбинантных продуцентов в ферментёрах были оптимизирвоаны следующие показатели: оптимальная среда для культивирования рекомбинантных продуцентов, концентрация и режим внесения индуктора – метанола. Таким образом были получены продукции фермента в количестве до 1000 Ел/мл культуральной жидкости. Дальнейшая обработка культуральной жидкости заключается в удалении биомассы продуцента, удалении мелких частиц, концентрирования культуральной жидкости и сушке гидролаз на твёрдой подложке. В качестве твёрдой подложки предпочтительно использовать крахмал. Отработана схема получения бактериолитических ферментных препаратов. Схема включает культивирование рекомбинантных продуцентов, получение культуральной жидкости путём отделения биомассы, дальнейшее концентрирование культуральной жидкости, очистку гидролазы с помощью ионообменной хроматографии, лиофильная сушка белка. На основании отработанных схем культивирования и очистки Разработаны лабораторные регламенты получения ферментных препаратов в количестве четырёх штук. Наработаны экспериментальные образцы ферментных препаратов. Разработаны методы тестирования осахаривающих и бактериолитических ферментных препаратов. На основании разработанных методов созданы программы исследовательских испытаний ферментных препаратов. Проведены испытания осахаривающих ферментных препаратов. Обнаружено, что фермент обладает высокой стабильностью и осахаривающей способностью. Программа испытаний полностью выполнена, ферментные препараты соответствуют ТЗ - пункт 4.1.6. Проведёны испытания бактериолитических препаратов. Показано, что препараты обладают высокой активностью в широком диапазоне температур и при нейтральных и щелочных величинах рН. Препараты эффективно лизируют клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, но в отношении живых клеток активны в отношении грамположительных бактерий. Программа испытаний полностью выполнена, ферментные препараты соответствуют ТЗ - пункт 4.1.7. Проведён рентгеноструктурный анализ 10 кристаллов гидролаз, получены дифракционные данные. Проведено материально-техническое обеспечение работ за счёт внебюджетных средств.

Этап 5. Обобщение и оценка результатов исследований.

На Этапе 5 создан РИД – подана заявка на получение патента. В связи с этим проведены дополнительные патентные исследования. Проведены исследования условий хранения при нескольких температурных режимах. Температурные режимы, при которых хранились лиофилизированные бактериолитические ферментные препараты и осахаривающие ферментные препараты, практически не повлияли на активность за данный период времени. На основании данных рентгеноструктурного анализа, полученных на предыдущем этапе, были построены трёхмерные модели 10 рекомбинантных гидролаз. Все полученные структуры зарегистрированы в базе PDB. Проведено масштабирование культивирования продуцентов осахаривающих гидролаз и бактериолитических гидролаз в ферментёрах объёмом 100 л. Обнаружено, что увеличение объёма ферментёра и количества пересевов культуры для разгона инокулята, не ведёт к снижению продукции ферментов. Были разработаны проекты опытно-промышленных регламентов. Проведены работы по разработке рекомендаций по применению ферментных препаратов. Обнаружена оптимальна доза внесения ферментных препаратов для осахаривания растительного корма. Показано, что внесение бактериолитических препаратов подкожно является эффективным способом лечения сепсиса у мышей. Проведено технико-экономическое обоснование производства ферментных препаратов. Подведены итоги работы. Разработаны инструкции по применению ферментных препаратов. Разработаны проекты Опытно-промышленных регламентов получения ферментных препаратов. Проведены дополнительные патентные исследования. Разработаны рекомендации по применению ферментных препаратов.

Полученные в ходе ПНИ научно-технические данные соответствуют и превышают мировой уровень. Разработанные препараты для осахаривания кормов животных обладают высокими коммерческими характеристиками, что подтверждается проведением сравнительных с коммерческими препаратами испытаний. Препарат для лечения и профилактики бактериальных заболеваний животных является уникальным и не имеет налогов на рынке, что позволяет применять этот препарат, в том числе в при замене антибиотикотерапии. В качестве результата работы могут быть использованы ферментные препараты для сельского хозяйства, которые могут повысить продуктивность сельскохозяйственных животных как за счёт улучшения питательных свойств кормов животных, так и за счёт снижения их заболеваемости. Вторым важным итогом ПНИ является отработка универсальной методики получения ферментных препаратов по схеме: поиск генов в геноме – клонирование необходимых генов – получение рекомбинантных продуцентов ферментов – изучение полученных ферментов – отбор ферментов с оптимальными свойствами – разработка технологических процедур получения ферментов. То есть, в результате работы отработана методика, позволяющая от гена дойти до технологического регламента. Таким образом, дальнейшая работа с помощью результатов ПНИ может быть продолжена по двум направлениям: дальнейший отбор и наработка ферментных препаратов из уже клонированных генов и поиск генов новых ферментов, под другие задачи и области промышленности (пищевая, медицинская и т.д.).


142290 Московская область, г.Пущино, пр-т Науки, д.5, Тел./факс: (495)956-33-70, boronin@ibpm.pushchino.ru; rta@ibpm.pushchino.ru; www.ibpm.ru


Разработка сайта - Alces