Заведующий – доктор биологических наук Александр Григорьевич Меденцев

2008 г. – год образования лаборатории. 

Руководитель – д.б.н. Меденцев Александр Григорьевич.

Лаборатория создана на основе группы биоэнергетики Лаборатории анаэробного метаболизма, возглавляемой до 2007 года д.б.н., проф. Акименко В.К.

Направление исследований

● Изучение механизмов устойчивости грибов и бактерий к стрессовым воздействиям.

Основные достижения

● Впервые показано, что стресс-реакции проявляются как изменения энергетического и антиоксидантного статусов клетки.

В результате многолетних исследований адаптационного потенциала грибов и дрожжей (Fusarium, Trichoderma, Yarrowia lipolytica) обнаружено, что одной из мишеней действия стресс-факторов является дыхательная цепь, повреждение которой прямо или косвенно приводит к образованию активных форм кислорода, снижению внутриклеточного содержания АТФ и цАМФ. Снижение концентрации цАМФ как негативного фактора транскрипции у грибов приводит к активации защитных механизмов.

С помощью ингибиторного анализа впервые установлено, что одним из компонентов сложного адаптивного ответа является «включение» альтернативного пути переноса электронов - цианидрезистентной оксидазы. Основная функция альтернативной оксидазы состоит в поддержании окислительной активности клеток и сохранении способности к синтезу АТФ в первом пункте сопряжения на уровне эндогенной НАДН-дегидрогеназы.

В качестве стрессового ответа в клетках грибов и дрожжей также происходит увеличение активностей антиоксидантных ферментов: каталазы, супероксиддисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионредуктазы.

● Совместно сотрудниками лаборатории цитологии микроорганизмов ИБФМ РАН и Института микробиологии им С.Н. Виноградского РАН (НИЦБ РАН) впервые обнаружено, что в процессе адаптации к различным стрессовым воздействиям происходят реструктуризация клеток и образование новых ультраструктур.

Впервые показано, что не зависимо от вида стресс-фактора у дрожжей Y. lipolytica происходит модификация клеточной оболочки: образование мембранных везикул, канальцев, многослойной плазмалеммы, а также глобулярных структур.

Впервые с помощью рентгеновского микроанализа тонких срезов было показано образование в стрессовых условиях полифосфатных гранул и установлено 2 места их локализации: в цитоплазме и лизосомах.

Впервые в качестве стресс реакции обнаружена аккумуляция кремния у дрожжей.

● Была обнаружена однотипность реакций дрожжей на различные стрессовые воздействия, а также перекрестная устойчивость (когда один вид стресса вызывает устойчивость к другим стрессовым воздействиям).

● Показано, что в стрессовых условиях Y. lipolytica синтезируют НАД⁺-зависимую алкогольдегидрогеназу и L-лактатоксидазу.

● Созданы научные основы для высокотехнологичного процесса получения L-лактатоксидазы.

Получен активный продуцент и выбран оптимальный режим синтеза фермента дрожжами Yarrowia lipolytica в условиях погруженного культивирования в биореакторах лабораторного типа. Фермент был выделен из культуральной жидкости и очищен до гомогенного состояния с использованием гидрофобной и ионообменной хроматографии. Выход целевого продукта составлял 45%, активность - 55.3 Е/мг белка. Фермент проявлял строгую специфичность к L-лактату. L-лактатоксидаза широко применяется в медицине, пищевой промышленности, виноделии. Узкая субстратная специфичность обеспечивает перспективу практического применения фермента в биотехнологии для создания биосенсоров, а также для разделения рацемических смесей. 

● Разработана высокоэффективная технология получения противоопухолевого фермента L-лизин-α-оксидазы.

В рамках изучения адаптации и биосинтетического потенциала микроорганизмов в ответе на стрессовые воздействия изучен синтез L-лизин-a-оксидазы грибами рода Trichoderma. L-лизин-α-оксидаза является перспективным ферментом в энзимотерапии опухолей, основанной на разной чувствительности нормальных и опухолевых клеток к дефициту факторов роста, в том числе, аминокислот.

В результате скрининга среди грибов рода Trichoderma найден активный природный штамм-продуцент, который идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН.

Изучены физиолого-биохимические пути регуляции биосинтеза, определены оптимальные условия культивирования, разработан метод выделения и очистки фермента. Получен гомогенный препарат фермента с высокой удельной активностью (90 Е/мг белка), изучены его физико-химические свойства.  Написан регламент получения L-лизин-α-оксидазы.

● Совместно с сотрудниками РУДН РАН и НМИЦ онкологии имени Н. Н. Блохина Министерства здравоохранения РФ проводятся доклиническое изучение специфической противоопухолевой активности.

In vitro показан цитотоксический эффект на культурах клеток (лейкимия, рак кишечника, карцинома молочной железы, аденокарцинома яичников, карцинома простаты). Терапевтический эффект in vivo показан на животных с перевивными опухолями: карцинома молочной железы SKBR3, меланома Бро, рак кишечника HCT116 and LS174T, аденокарцинома яичников SCOV3, карцинома печени.

Показано, что лизиноксидаза из Trichoderma может интернализоваться в кишечнике и проявлять противоопухолевое, антибактериальное и противовирусное действия in vivo. Выявлено, что лизиноксидаза снижает концентрацию аминокислот (L-лизина, орнитина и аргинина) и полиаминов в мозге, что предполагает ее эффективность при лечении не только онкологических заболеваний, но и нейродегенеративных заболеваний, связанных с нарушением метаболизма лизина в мозге.

● Показан синтез антимикробного низкомолекулярного пептида грибом Trichoderma cf. аureoviride Rifai ВКМF-4268D и определен его аминокислотный состав. Изучен механизм антимикробного действия пептида, обусловленный деэнергизацией цитоплазматической мембраны бактерий или внутренней мембраны митохондрий.

● Показано, что стрессовые воздействия (включая экстремальные значения рН, окислительный стресс, недостаток в среде источников углерода, азота, фосфора, действие ингибиторов дыхания или фитоалексинов) провоцируют биосинтез пигментов нафтохиноновой природы грибами рода Fusarium. Установлен механизм антибиотического и фитотоксического действия нафтохинонов. Определен механизм устойчивости гриба-продуцента к собственным метаболитам.

● Изучена организация и функционирование уникальной терминальной метакрилатной редокс системы у анаэробной дельта-протеобактерии Geobacter sulfurreducens AM-1, способной восстанавливать токсичное синтетическое соединение метакрилат.

Совместно с Центром регуляции генома (Barcelona, Spain), был секвенирован полный геном G. sulfurreducens AM-1 и идентифицированы гены, кодирующие белки метакрилатной редокс системы: флавинсодержащую метакрилатредуктазу Mrd и мультигемовый цитохром с Mcc. Обнаружены еще несколько бактерий, в геномах которых имеются гены-гомологи компонентов ферментной системы, восстанавливающей метакрилат. Осуществлены клонирование и гетерологичная экспрессия генов mrd и mcc G. sulfurreducens AM-1 в аэробнорастущих клетках E. coli. В настоящее время изучаются рекомбинантные препараты Mrd и Mcc G. sulfurreduces AM-1, полученные из клеток E. coli.

● Для более полного понимания биологического действия различных метаболитов (в том числе ферментов, пептидов) в лаборатории применяются оригинальные кинетические подходы – предложен векторный метод представления ферментативных реакций. Метод расширяет возможности исследований механизма действия метаболитов, определять сайты и константы их связывания, позволяет контролировать дыхательные цепи бактерий и митохондрий.

Опубликовано 75 научных статей в российских и международных изданиях. Защищено 1 докторская и 2 кандидатских диссертации. Получено 2 патента на изобретения. Выполнено 9 проектов по грантам международных и российских фондов, соглашениям минобрнауки.

medentsev-ag@rambler.ru