Разработан новый межгосударственный стандарт «ГОСТ 9.050–2021. Единая система защиты от коррозии и старения. Покрытия лакокрасочные. Методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов». 

ГОСТ разработан  по результатам многолетних исследований  устойчивости к воздействию плесневых грибов более 660 образцов промышленных материалов и изделий, проводимых во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ ИБФМ РАН). Установлен набор штаммов, наиболее активно деградирующих лакокрасочные покрытия, проведен анализ их фенотипических и генотипических характеристик, определен таксономический статус и показатели активности. В ГОСТ вошли конкретные номера штаммов, содержащиеся и хранящиеся в ВКМ.  ГОСТ разработан совместно с ФГУП Российский институт стандартизации и вступил в действие 01.06.2022 г.

– руководитель работы - в.н.с. д.б.н. Озерская С.М., исполнители к.б.н. Иванушкина Н.Е. (499 783-29-58), к.б.н. Кочкина Г.А. (499-783-29-52), ivanushkina58@mail.ru

Публикация: Приказ № 1221-ст от 21 октября 2021 г. Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт) - ГОСТ 9.050-2021 (https://docs.cntd.ru/document/1200181232).

.

Основные  результаты, полученные в ИБФМ РАН в 2022 г.

1.6.3. – Биологическое разнообразие и биоресурсы  

Сеть российских микробных коллекций на базе ВКМ.

• Впервые создана распределенная информационная сеть российских микробных коллекций, с консолидированной каталожной базой данных и интерактивным электронным каталогом на ее основе (http://www.vkm.ru/Cosolidated.htm). База данных содержит более 21000 штаммов микроорганизмов различных групп (бактерии, актиномицеты, археи, мицелиальные и дрожжевые грибы). Сводный каталог с он-лайн доступом к нему из «единодного окна» включает более 9600 штаммов, относящихся к 5600 видам и подвидам. Поиск штаммов в каталоге осуществляется по коллекционным номерам и таксономическим названиям; результат поиска выводится с указанием акронима коллекции, в которой он поддерживается. Созданная сеть (с предусмотренной возможностью присоединения к ней других российских микробных коллекций) отвечает мировым тенденциям коллекционной деятельности, способствует повышению эффективности исследований, связанных с изучением и практическим использованием микробного разнообразия (отдел ВКМ, рук. д.б.н. Евтушенко Л.И.)

• 1.6.3.  Биологическое разнообразие и биоресурсы

• Филум Actinobacteria включает важные для человека бактерии, в их числе патогены и продуценты вторичных метаболитов, представляющих практический интерес. В настоящее время лишь 30–50% прогнозируемого филогенетического разнообразия актинобактерий представлено отсеквенированными геномами. В настоящей работе проанализировано 824 генома изолятов актинобактерий из 6700 имеющихся геномов организмов всего филума. На основе анализа функций генов выявлены новые детерминанты взаимодействия хозяин-микроб и детерминанты адаптации к окружающей среде, в их числе потенциальные антимикробные пептиды. Анализ более 80000 кластеров биосинтетических генов показал, что горизонтальный перенос генов во многом определяет специфичность спектров вторичных метаболитов в разных таксонах филума.  (ВКМ, рук. д.б.н. Евтушенко Л.И)

• На основании методов полифазной таксономии и филогеномного анализа описан новый вид Ancylobacter moscoviensis sp. nov. штамм 3С (ВКМ В-3218 = KCTC 62336), проведена таксономическая ревизия семейства Hyphomicrobiaceae и реклассификация представителей родов Starkeya, Angulomicrobium и Methylorhabdus. Предложены новые подходы для идентификации бактерий рода Ancylobacter с использованием современных методов. Охарактеризованы новые биотехнологически перспективные штаммы аэробных метилотрофных бактерий и секвенированы их геномы – ‘Ancylobacter crimeensis’ 6x-1 (JALKCH000000000) и ‘Aurantimonas soli’ MH4 (JAJAVB000000000) и термотолерантного метанотрофа Methylococcus capsulatus MIR (CP097161.1). Впервые анализ функциональных генов НАД⁺–зависимой формиатдегидрогеназы (НАД⁺–ФДГ) рекомендован в качестве дополнительного критерия для межвидовой дифференциации метилотрофных бактерий рода Ancylobacter. Выявлена высокая консервативность белка НАД⁺–ФДГ у представителей родов Ancylobacter, Starkeya и Angulomicrobium (лаб. радиоактивных изотопов, рук. к.б.н. Мустахимов И.И.).

• С поверхности личинки тритона выделена грамположительная бактерия Microbacterium paraoxydans, шт. Ltr1, которая по цитолого-генетическим характеристикам может быть отнесена к ультрамикробактериям (УМБ) (Duda et al. Ultramicrobacteria. Encyclopedia of Life Sciences 2020). Для бактерий, принадлежащих к виду M. paraoxydans впервые обнаружена антимикробная активность в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе бактериальных фитопатогенов. Впервые при помощи комплекса цитологических и микробиологических подходов для бактерий рода Microbacterium показана способность и индуцибельный характер секреции везикул, содержащих антимикробный агент. Антимикробный агент (АА) инкапсулирован в везикулы цитоплазматической  мембраны (ЦМ), диаметром 75 - 100 нм (Рис. а-в). Предложен надмолекулярный механизм формирования везикул ЦМ (Схема I-IV) и инвазии антимикробного агента в клетки бактерии-жертвы на примере грамположительной бактерии Deinococcus radiodurans и грамотрицательной фитопатогенной бактерии Erwinia herbicola. Показано, что механизм антимикробного воздействия происходит по типу “Wolf park” (“волчья стая”)

(Рис. а)

Рис (а-в). Трансмиссионная электронная микроскопия. Стратегия “Wolf park” (“волчья стая”) (Рис. а), реализуемая новым изолятом грамположительной хищной бактерии Microbacterium paraoxydans, шт. Ltr1 при участии везикул (В) цитоплазматической мембраны (ЦМ) (Рис. б, в). Везикулы ЦМ формируются в нескольких хаотично расположенных по поверхности мембраны сайтах (Рис. б) и высвобождаются в межклеточное пространство (Рис.в).

Схема формирования везикулы ЦМ с инкапсулированным антимикробным агентом (I-IV). Антимикробный агент (АА), локализованный вблизи ЦМ на периферии цитоплазмы клетки (Ц) (I) постепенно замыкается внутри инвагинации ЦМ по мере её разрастания внутрь цитоплазмы (II). Инвагинация ЦМ полностью окружает АА, после чего происходит слияние мембран в точке контакта с другим участком ЦМ (ССМ – сайт слияния мембран) (III) и процесс формирования везикулы ЦМ с инкапсулированным в ней АА завершается. Выход везикулы в межклеточное пространство происходит в результате пассивной диффузии (лаб. цитологии микроорганизмов, рук. к.б.н. Сузина Н.Е.).

1.6.8. Биохимия, биофизика и структурная биология

• Дрожжи обладают слаженной системой реагирования на различные стрессы. К числу многочисленных белков, участвующих в адаптивных процессах у S. cerevisiae, относятся мембранный белок Mnc1, кодируемый геном YBR056W-A, и его неаннотированный ортолог, кодируемый геном YDR034W-B. Эти белки входят в семейство CYSTM и содержат богатый цистеином трансмембранный модуль. С помощью штаммов, содержащие GFP-слитые гены, кодирующие Mnc1 и YDR034W-B, показано, что в контрольных условиях эти белки не экспрессируются. Их экспрессия вызывается стрессами, при которых нарушается трансмембранный градиент протонов цитоплазматической мембраны. Делеционные мутанты по этим генам имеют сниженную устойчивость к стрессу, вызванному ионами марганца.  Таким образом, установлена функция CYSTM белков дрожжей – они участвуют в адаптации к стрессу, вызванному токсической концентрацией ионов марганца, причем YDR034W-B, по-видимому, связывает эти ионы на уровне цитоплазматической мембраны, а YBR056W-A – на уровне внутриклеточных мембран (Лаб. регуляции биохимических процессов, д.б.н. Кулаковская Т.В.)

• Микрофотографии клеток штаммов YBR056W-A-GFP и YDR034W-B-GFP, флуоресцентная микроскопия: C – контрольное культивирование,  Mn - культивирование в присутствии 2 мМ Mn²⁺, 1- цитоплазматическая мембрана, 2- внутриклеточные мембраны

Разработаны уникальные метод культивирования дрожжевой культуры C. maltosa на гидрофобном источнике углерода и метод отделения экзацеллюлярного вещества секреторных путей – каналов. При использовании жидкой среды Yeast nitrogen base и 1% дрожжевого экстракта в качестве дополнительного источника азота в условиях низкой аэрации на качалке-шейкер (“Sunflower” типа) клетки образовывали микросферы, которые свободно перемещались по всему пространству колбы в водной среде до гидрофобной фазы. При делении почки не отходили от материнских клеток и не переходили в планктонную форму, что позволило сфероидам с иммобилизованными окислительными ферментами в экзоцеллюлярном веществе оставаться более эффективными, чем одиночным клеткам. Конфокальная микроскопия с бензапиреном показала наличие гидрофобных участков, распределенных дискретно по клеточной стенке, и

захваченные капли гексадекана. Перенос этих клеток на среду без источника углерода приводил к распаду сферической колонии на одиночные клетки и выброс вещества каналов во внешнюю среду. Обнаружен неизвестный ранее для рода Candida тип роста в водной среде с гидрофобным источником углерода и метод отделения экзацеллюлярного вещества, что может иметь практическое значение для биотехнологии или при изучении кандидозов.

Рис. 1. А - сферические колонии в колбе, Б – сферические колонии на разделе фаз, В – флуоресцентная микроскопия с бензапиреном, мультифокусное сложение 100 оптических срезов, синий сигнал – гексадекановые капли и гидрофобные соединения.

Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия сферических колоний.

Рис. 3. Компьютерная модель этапов выброса вещества каналов во внешнюю среду. К – канал, ОФ – окислительные ферменты, БВ – белковая везикула (ВНТК  трехмерных структур микроорганизмов, рук. к.б.н. Дмитриев В.В.).

• Комбинированные молекулярные и биохимические исследования, гомологическое моделирование, расчет электростатического потенциала на поверхности Коннолли при рН 5,0 и рН 7,0, структурный анализ новой алкалофильной лакказы Myrothecium roridum VKM F-3565 и алкалофильных/ацидофильных лакказ грибов с известной структурой позволили впервые в мире обнаружить новый внутримолекулярный канал у алкалофильных грибных лакказ, расположенный вблизи одного из каталитических остатков аспартата при атоме Т2-меди. Аминокислотные остатки, формирующие этот канал, предположительно служат донорами протонов для каталитических остатков аспартата Т2/Т3 центра, обеспечивая их правильное функционирование в ходе каталитического процесса в нейтрально-щелочных условиях среды. Впервые показано образование новых тримерных продуктов конденсации фенилпропаноидов с помощью алкалофильной грибной лакказы в нейтральной среде, которые могут иметь потенциал для использования в фармакологии (Лаб. энзиматической деградации органических соединений, рук. к.б.н. Коломыцева М. П.).

• Проведено полногеномное секвенирование хромосомной ДНК перспективного штамма-продуцента антимикробных агентов Lysobacter capsici VKM B 2533^Т. Полученная геномная сборка депонирована в GenBank под номером JACXXL000000000. Проведено транскриптомное исследование этого штамма на средах, способствующих продукции антимикробных агентов. В результате, помимо генов известных и охарактеризованных бактериолитических ферментов, выявлены гены неизвестных ферментов с потенциальной бактериолитической активностью. Для этих генов будут разрабатываться экспрессионные системы с целью получения целевых белков и их дальнейшей характеризации. Получена гомологичная система экспрессии в клетках L. gummosus для β – литической протеазы под контролем Т5промотора на основе экспрессионного вектора pBBR1–MCS5blp–P_T5. Выявлено, что бактериолитическая активность L. gummosus blp P_T5 превышает показатель L. gummosus дикого типа в 45 раз (Лаб. биохимии клеточной поверхности микроорганизмов, рук. к.б.н. Леонтьевская Н.В.)

1.6.3. Вирусология

• Выявлен ряд бактериофагов, заражающих Bacillus pumilus и Pseudomonas syringae, вирионы которых обладают широким диапазоном рН- и термостабильности. Были определены последовательности геномов этих бактериофагов. Охарактеризованные бактериофаги являются перспективной платформой для конструирования на основе их вирионов искусственно модифицированных вирусов. Результаты опубликованы в научных рецензируемых журналах первого и второго квартиля (Лаб. биологии вирусов бактерий, рук. к.б.н. Шадрин А.М.)

1.6.12. Биотехнология и синтетическая биология

• Установлено, что дрожжи вида Yarrowia lipolytica растут на отходе спиртовых заводов - эфироальдегидной фракции (ЭАФ) и синтезируют кетоглютаровую кислоту (КГК) в условиях дефицита тиамина. В качестве продуцента КГК из ЭАФ селекционирован штамм Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2412, для которого подобраны оптимальные концентрации тиамина, микроэлементов и ЭАФ, обеспечивающие синтез 50 г/л КГК с минимальным содержанием побочных продуктов. Селекционированы природные и мутантные штаммы дрожжей Y. lipolytica, которые растут и синтезируют лимонную кислоту (ЛК) и/или цитрат натрия не только на чистой глюкозе, но также на глюкозном и глюкозно-фруктозном сиропах, полученных из вторичных продуктов глубокой переработки зерна пшеницы и кукурузы; определены кинетические и балансные соотношения в процессе биосинтеза ЛК на этих субстратах при различных концентрациях сульфата аммония (Лаб. аэробного метаболизма микроорганизмов, рук. д.б.н. И.Г. Моргунов).

• Разработаны научно-практические основы биотехнологии для производства стероидных 17β-спиртов из растительных стеринов. Выявлены и оптимизированы условия, способствующие 17β-восстановлению С17-кетоандростанов (андростендиона, андростадиена), образующихся в качестве интермедиатов окисления фитостеринов миколицибактериями. Метод позволяет получать ценные 17-восстановленные андростаны из фитостерина без выделения и очистки 17-кетоандростанов. Достигнуты выходные показатели, превышающие известные мировые аналоги (лаб. микробиологической трансформации органических соединений, рук. д.б.н. Донова М.В.)

• Проведено исследование генома Rhodococcus opacus S8 и изучение особенностей поведения этого штамма, выращенного в присутствии гексадекана. При культивировании штамма R. opacus S8 на гексадекане было обнаружено значительное (p-value < 0,01) увеличение количества мРНК гена alkB. Анализ генома показал наличие генов, отвечающих за деградацию алканов и синтез биосурфактантов. Обнаружено, что штамм образует два гликолипидных продукта, Rf 0,55 и Rf 0,65, тогда как до сих пор большинство известных биосурфактантов родококков, описанных в литературе, являлись гликолипидами с образованием нескольких гомологичных продуктов (Лаб. физиологии микроорганизмов, рук. д.б.н. проф. Вайнштейн М.Б., исп. с.н.с. к.б.н. Делеган Я.А.).